適用于激光熒光顯微鏡的光學(xué)濾光片

介紹

因為激光具有高亮度、穩(wěn)定、長壽命及譜線窄等特性，它正逐漸取代了熒光成像應(yīng)用中的傳統(tǒng)寬帶 光源。在成像應(yīng)用中，激光的上述特性可提高可視化的靈敏度，也增加了光通量；激光更具有光束發(fā)散 角窄、高度的時空相干性、偏振特性明確等獨/有特性，從而催生了眾多新的熒光成像技術(shù)。然而，相對 于寬帶光源，當(dāng)激光以熒光光源的形式出現(xiàn)時，為基于激光的成像系統(tǒng)（如共聚焦和全內(nèi)反射熒光（TIRF） 顯微鏡）及其組件提出了新的限制要求。尤其是對光學(xué)濾光片有著更特殊的要求。

針對激光光源進行優(yōu)化的光學(xué)濾光片

在過去四十多年里，已開發(fā)出了許多強大、高效且性價比好的激光器。人們通常按增益介質(zhì)和激勵 方式對激光器進行分類。至今，受歡迎的用于熒光成像的激光器仍為氣體激光器（如氬離子和氪離子 激光器）常用的激光譜線為488、568和647nm。但在最近幾年，由于固態(tài)激光器的（電光轉(zhuǎn)換）效率明 顯更高（產(chǎn)生的熱量更低，實驗室安裝更加簡單）、尺寸更小，且成本更低，因此正在逐漸取代了體激 光器。比較流行的激光器類型包括半導(dǎo)體二極管激光器（尤其是405和635nm）、光泵浦半導(dǎo)體激光器（包 括廣泛使用的488nm），以及倍頻二極管泵浦固態(tài)（DPSS）激光器（包括561nm的黃光激光器和較新的515nm 和594nm激光器）。表1總結(jié)了在熒光成像應(yīng)用中最/受歡迎的激光器。

激發(fā)濾光片：盡管尚有異議，但針對激光光源的消雜濾光片（激發(fā)濾光片）是十分重要的，可用它 阻擋不想要的非激光線波長的光，包括固態(tài)激光器中自發(fā)發(fā)射和氣體激光器的等離子線。這些濾光片不 僅要能夠濾掉的無用光（> OD 6），對于激光線也應(yīng)具有高透過率（T>95%）（請參見圖1和3）。此外， 這些濾光片還要耐用，以承受高強度的激光束的照射。

與沿用了幾十年的傳統(tǒng)軟鍍膜的熒光濾光片不同，通過離子束濺射制作的新型硬鍍膜的薄膜濾光片 具有很高的激光損傷閾值（LDT）等級。Semrock 生產(chǎn)的的激光濾光片通常具有 1 焦耳/平方厘米或更高 的 LDT 等級，適用于強脈沖激光。對于連續(xù)（CW）激光器，該 LDT 等級相當(dāng)于 10-100 千瓦/平方厘米。 此外，硬鍍膜濾光片幾乎不受溫度和濕度引起的環(huán)境退化的影響；由于具有高光學(xué)耐久性以及穩(wěn)固的環(huán) 境可靠性，在大多數(shù)熒光顯微鏡應(yīng)用中無需更換濾光片。

表1：常用熒光激光器

“DPSS”= 二極管泵浦固態(tài)激光器“OPS”= 光泵浦半導(dǎo)體激光器“倍頻”= 通過非線性光學(xué)晶體實現(xiàn)倍頻

用于激光器的激發(fā)濾光片還具有*的波長要求。有些激光器，如氣體激光器和DPSS激光器，具有非 常精確和窄的激光譜線。適用于特定激光譜線的理想激發(fā)濾光片為窄帶激光譜線濾光片（典型帶寬＜激光 波長的0.4%），關(guān)鍵在于激光譜線的精確定位。Semrock的MaxLine®激光譜線消雜濾光片是該應(yīng)用的理想 選擇。但是，此類濾光片不適用于使用類似波長的多激光器的系統(tǒng)（如：激發(fā)GFP的473nm和488nm的激光 器，或?qū)砜赡苌壍?61nm DPSS激光的568nm氪離子激光器），也不適用于半導(dǎo)體激光器系統(tǒng)。

對于二極管和光泵浦半導(dǎo)體激光器來說，同一型號的激光器，因為溫度和使用年限的不同，每臺的光 譜輸出都會不同。因此，對于大多數(shù)此類激光顯微系統(tǒng)來說，采用與寬帶光源（如弧光燈）顯微系統(tǒng)類似 的寬帶激發(fā)濾光片是一個不錯的解決方案。例如，圖1所示的激發(fā)濾光片設(shè)計用于375nm和405nm的激光器， 而405nm激光器的長波邊緣需考慮±5nm的不確定性。但是，這些激發(fā)濾光片與寬帶光源濾光片并不*一 樣。濾光片除了精確定位相關(guān)激光器波長的邊緣位置，還需考慮其它重要因素，包括邊緣陡度和通帶紋波。 因為低紋波可確保特定激光譜線的高速傳輸，或隨著時間的推移，當(dāng)半導(dǎo)體激光器的波長產(chǎn)生漂移時，陡 邊緣可提供很高的光學(xué)噪聲的區(qū)分。

圖1：測量典型的激光熒光濾光片組測得的光譜性能；

藍色線 - 激發(fā)濾光片；綠色線 - 分色濾光片；紅色線 - 發(fā)射濾光片

發(fā)射濾光片：可對所有可能用于此濾光片組的激光線，典型的Semrock發(fā)射濾光片都提供很高的阻擋 （> OD 6），因而確保了最暗的背景噪聲水平；同時，還能夠?qū)Πl(fā)射信號提供很高的透過率（平均>97%）。 值得注意的是，并非所有寬帶光源的發(fā)射濾光片都能充分阻擋激光譜線，因此可能直接降低成像對比度。 與激發(fā)濾光片一樣，發(fā)射濾光片的邊緣波長應(yīng)與相關(guān)激光譜線匹配，且短波邊緣的陡度也有嚴(yán)格要求。相 關(guān)的其它注意事項包括：應(yīng)使用*光學(xué)質(zhì)量的玻璃作為基質(zhì)：自發(fā)熒光低，均勻性高，且楔角低，從而 最小化光束偏差（光束偏差會導(dǎo)致在更換濾光片時發(fā)生像素偏移）。

二向分光鏡：激光應(yīng)用的分光鏡不僅要使其透過和反射的頻帶與激發(fā)發(fā)射濾光片匹配，而且還需防反 射涂層，從而盡可能地提高發(fā)射光的穿透率和消除相關(guān)干涉影響。Semrock激光分光鏡可保證s偏振光透過 率>98%和激光波長的平均偏振>94%，即93%以上的平均透過率和透過極寬通帶（900nm-1200nm）的超低紋 波。分光鏡還應(yīng)具有類似于激發(fā)濾光片的LDT等級，且應(yīng)在反射帶上具有較低紋波，從而盡可能減小激發(fā) 光強度的變化。

由于二向分光鏡直接暴露于強激發(fā)光線中，即使是來自濾光片的弱自發(fā)熒光，都會干擾發(fā)射光的信號。 因此，應(yīng)采用超低自發(fā)熒光基質(zhì)，如熔融石英。請注意，由于激發(fā)光和發(fā)射信號的強度相差多個數(shù)量級（通 常是106），對于發(fā)射濾光片，關(guān)于自體熒光的要求不會像對分色分光器的要求那么嚴(yán)格。盡管如此，在 TIRF顯微鏡中，發(fā)射濾光片的光強度級明顯高于典型的螢光廣角熒光顯微鏡中濾光片，因為TIRF系統(tǒng)中的 激光束會從樣本載玻片上*反射并沿發(fā)射路徑返回重新定向。因此，相比寬帶系統(tǒng)中的自體熒光，應(yīng)更 仔細(xì)地考慮該激光系統(tǒng)中發(fā)射濾光片的自體熒光。

在某些應(yīng)用中，二向分光鏡會對圖像質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響，尤其是在分光鏡平整度（曲率）不適合的情 況下更為明顯。即使透過波前差（TWE）受基質(zhì)曲率的影響不太明顯，反射波前差（RWE）也會對成像質(zhì)量 產(chǎn)生明顯影響。例如，當(dāng)平整度不高的分光鏡置于激發(fā)光路[1]中，TIRF顯微鏡中的樣本照明可能會變?nèi)酢?同樣，由于硬涂層的固有彎曲應(yīng)力，所以可能會導(dǎo)致從分色鏡[2]反射的成像光束產(chǎn)生像差。因此，某些 應(yīng)用應(yīng)采用平整度很高的分光鏡。對于大多數(shù)激光顯微鏡應(yīng)用，分光鏡應(yīng)足夠平，這樣照明的激光束的焦 點就不會發(fā)生明顯位移，其中焦點位移通常是由瑞利范圍[1，2]來定義的。簡單來講，經(jīng)分光鏡反射的成 像光束（聚焦在探測器的陣列上，比如CCD）的合格標(biāo)準(zhǔn)是：經(jīng)分光鏡上的反射作用后，受衍射影響的光 斑尺寸不應(yīng)發(fā)生明顯變化。

多個光學(xué)濾光片組成的濾光片組：表2總結(jié)了用于激光系統(tǒng)的濾光片的關(guān)鍵特性?？偟膩碚f，濾光片最好 具有*的阻斷能力、對特定波長的光具有高透過率，同時不會影響受衍射限制的圖像質(zhì)量。這些簡單的 要求不僅會影響各個濾光片的設(shè)計，而且還會影響該組合中使用的濾光片系統(tǒng)的設(shè)計。因此，激發(fā)濾光片 和發(fā)射濾光片的設(shè)計，以及二向分光鏡的設(shè)計應(yīng)相互匹配，以獲得最高保真度的熒光可視化效果。

表2：激光成像系統(tǒng)用濾光片的關(guān)鍵特性總結(jié)。

例如，激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片的邊緣陡度是相互配合的。高邊緣陡度將對有限帶寬光的使用產(chǎn)生顯 著影響。因此，用于激光的濾光片組的激發(fā)片和發(fā)射片的分隔應(yīng)該非常小。此分隔通常小于 Semrock 激光 濾光片組中最大激光波長的 1.5%.同時，激發(fā)片和發(fā)射片的交叉邊緣位置應(yīng)具有足夠高的阻斷（> OD 6）， 以確保激發(fā)光不會泄漏到發(fā)射光的通道。

二向分光鏡和發(fā)射濾光片的組合性能還會對圖像配準(zhǔn)產(chǎn)生影響。重要的是，應(yīng)使用平整度*的玻璃 基質(zhì)，以盡量減少基質(zhì)的任何楔角（鍍膜前）以及鍍層應(yīng)力導(dǎo)致的彎曲。用于熒光應(yīng)用的濾光片采用全單 基帶通濾光片結(jié)構(gòu)，因此制造基質(zhì)時容易實現(xiàn)楔角的最小化（例如，激光發(fā)射片和分光鏡的楔角僅為幾弧 秒）。Semrock激光濾光片組自身就能提供出色的圖像配準(zhǔn)性能：當(dāng)相互交換這些濾光片組時，觀察不到 明顯的像素移位。通過激光濾光片組獲得的圖像不僅各熒光通道之間表現(xiàn)出極/好的圖像配準(zhǔn)度，還能與非 熒光通道的圖像進行極/好配準(zhǔn)（例如，微分干涉差成像（DIC）或其它明視場模式）。

對于單分子成像應(yīng)用，激光也是非常適合的光源。這類應(yīng)用要求十分嚴(yán)苛，如對發(fā)射光路混雜的激發(fā) 光要有非常嚴(yán)格的阻斷，同時最大限度地收集每一個從熒光基團發(fā)射的光子。在這種情況下，傳統(tǒng)的帶通 發(fā)射濾光片可被長波通濾光片代替（圖1). 長波通發(fā)射濾光片可從熒光基團捕獲最大信號，長波通濾光片 也可以極廣地分離了吸收和發(fā)射光譜。也有一些研究人員不使用發(fā)射片，只使用一片特定激光譜線的陷波 濾光片，因為此類濾光片能在激光器波長兩側(cè)提供最大透過率。在我們的觀察中，一些要求苛刻的應(yīng)用（尤 其是TIRF系統(tǒng)）甚至可采用一個第二發(fā)射片或者采用一個陷波濾光片與各種激光濾光片組結(jié)合并達到較好 效果。采用第二濾光片（與第一發(fā)射片不相接觸）的主要目的是：確保高角度的散射激發(fā)光不會穿過整個 成像光路達到探測器[1]。

同時使用多個激光器

許多新的成像方法都基于安裝多個激光成像系統(tǒng)：兩色、三色，甚至四色系統(tǒng)都是非常常見的。

樣本采用多個熒光基團進行標(biāo)記，這些熒光基團需在特定條件下才能清楚地看到。因此，就有必要合 并多個激光束（多重合并，或簡稱為 MUX）或分離某一復(fù)合激光束。相對于只用于成像的二向色鏡，用于 此類應(yīng)用的二向分光鏡合并/分離具有*的要求。Semrock 的 LaserMUX™光束合成器（圖 2）提供高透過 率（透過率 R 大于 95％），以及對重要激光譜線的極優(yōu)的反射性能（反射率 R 大于 98％），從而實現(xiàn)損 失的最小化。

圖2：合并激光束進行多色成像。

上圖：描述LaserMUX™二向分光鏡如何用于合并（多重合并）或分離（多路分離）激光束。

下圖：LaserMUX濾光片的典型測量光譜。

用于同時多激光成像的激發(fā)片和發(fā)射片以及二向分色鏡特別具有挑戰(zhàn)性。帶通濾光片必須具有多個傳 輸和阻斷帶（兩色、三色，甚至四色），同時需具有上述激光濾光片的各種特性，例如：非常適合激光譜 線的高傳輸和高阻斷，高邊緣陡度和精確對應(yīng)正確的激光譜線。要求多邊緣的分光鏡能夠選擇性地從其發(fā) 射信號中分離出用于不同熒光基團的激發(fā)光。

由于有能力地生產(chǎn)多邊緣濾光片，且各邊緣都采用高陡度設(shè)計，因此可實現(xiàn)多個熒光基團的極/佳信噪 比，同時最大幅度消除熒光串色(Crosstalk)（圖 3).

圖4中顯示了可用于多種不同類型成像應(yīng)用的多激光系統(tǒng)示例。突出顯示的是不同類型的光學(xué)濾光片。 在該示例中，結(jié)合了三個激光器，且該系統(tǒng)演示了通過退掃描和非退掃描探測路徑的共焦掃描，各路徑均 可實現(xiàn)同時多顏色探測。或者，如果沒有掃描功能，可與兼容TIRF的物鏡一起使用，進行TIRF成像。

圖3：Semrock四色激光濾光片組組適用于以下規(guī)格的激光器：375、405、473、488、491、559、 561、568、633、635和647納米的激光器；

藍線 - 激發(fā)濾光片，綠色 - 分色鏡，紅色 - 發(fā)射濾光片

結(jié)語

基于激光的顯微鏡成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價格昂貴，在從其中獲得最高性能的過程中，光學(xué)濾光片的作 用至關(guān)重要。正確的選擇使用與其性能匹配的光學(xué)濾光片更加重要。基于激光的成像系統(tǒng)的未來將會如 何？為了更好地觀察細(xì)胞或亞細(xì)胞相互作用機制，涌現(xiàn)了眾多的復(fù)雜的成像方案。例如，位于先進技術(shù)前 沿的超分辨率成像技術(shù)通常使用激光照明[3]。這些技術(shù)已經(jīng)增進了成像的分辨率，達到遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)顯微 鏡的衍射極限（限制到幾百納米的分辨率）。

其他的幾種熒光成像技術(shù)，如 STED、PALM 和 STORM（在此不一一列舉），已證明了可以使用不同方法， 在觀察熒光標(biāo)記樣本時達到幾十納米的分辨率。這些成像技術(shù)的前提是基于能準(zhǔn)確定位單個熒光分子。由 于定位的精度隨著從給定熒光基團分子[4]獲得的光子數(shù)增加而顯著增加，高效的光學(xué)濾光片在這些前沿 應(yīng)用中發(fā)揮了日益重要的作用。

圖4：復(fù)雜多激光器成像系統(tǒng)示例。特定激光濾光片為藍色突出顯示。